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近日，《天然通信》上发布了一篇名为《东说念主类造血干细胞中的高频率CCR5裁剪可保护异种移植小鼠免受 HIV 感染》的著述。

这项辩论模仿了柏林患者的休养陶冶，该患者被宇宙公以为第一例通过干细胞移植休养HIV的患者。辩论者们通过CRISPR/Cas9期间对东说念主类造血干祖细胞（HSPC）进行CCR5基因裁剪，生效终明晰90%以上的CCR5裁剪，况兼移植后的细胞梗概正常进行造血，生成衰败CCR5的T细胞，从而使小鼠对HIV感染具有免疫拒抗力。

执行还发现，当CCR5裁剪率低于90%时，保护遵守会缓缓松开，而在裁剪率越过90%时，能有用防护HIV感染和复制。

这些完结标明，欺骗CRISPR期间对HSPC进行高频CCR5裁剪，不仅可行，而且梗概有用拒抗HIV感染，为HIV的休养辩论提供了新的想路。

01造血干细胞移植

天然现存的抗HIV休养不错礼貌病毒，但不可休养HIV，因此仍在寻找新的休养尺度。几位患者通过罗致带有CCR5Δ32/Δ32基因突变的造血干细胞移植，生效终明晰HIV弥远缓解，这阐述HIV休养是可能的。不外，由于这类移植的复杂性和风险，难以畴昔应用。

基因裁剪期间，尤其是CRISPR/Cas9的逾越，带来了新的但愿。通过在患者我方的造血干细胞中裁剪CCR5基因，不错幸免异体移植的风险，并终了自体移植。但要高效裁剪CCR5基因仍然存在挑战，尤其是在保抓细胞的多能性和移植材干方面。

辩论标明，要有用防碍HIV复发，需要较高频率的CCR5基因裁剪，至少达到90%。

文中辩论通过CRISPR/Cas9生效在成东说念主的造血干细胞中终明晰越过90%的CCR5裁剪，且这些裁剪后的细胞保抓了正常的造血材干，并能有用拒抗HIV感染。这为畴昔自体CCR5基因裁剪移植休养HIV提供了伏击的辩论基础。

02研发CCR5裁剪基因

发现过程识别出最好CCR5特异性指示RNA

辩论东说念主员通过计算机瞻望和体外筛选相伙同，找到了能高效裁剪CCR5基因的最好指示RNA（gRNA）。领先，他们计算出123个可能在CCR5基因上酿成双链断裂的gRNA，并遗弃了15个可能与其他基因伙同的gRNA。

剩下的108个gRNA在执行中与Cas9卵白伙同，测试了它们在成东说念主动员的造血干细胞中的裁剪遵守。完结发现，其中11个gRNA的裁剪遵守越过30%，且不与CCR2基因同样，因此被选中进行进一步优化。

在进一步测试中，辩论团队通过电穿孔期间进行裁剪，并通过深度测序搜检可能的非靶向裁剪（即不在指标基因上的空幻裁剪）。

完结线路，除一个gRNA（TB8）外，其它三个gRNA险些莫得发生非靶向裁剪。最终，他们笃定了四个高效且安全的gRNA，并遴荐这些行动进一步执行的基础。

最好CCR5靶向gRNA显赫减少东说念主类T细胞名义的CCR5抒发

辩论东说念主员测试了四种最好的gRNA（TB7、TB8、TB48和TB50），望望它们是否梗概有用裁剪CCR5基因，并影响T细胞名义的CCR5卵白抒发。

完结线路，所有四种gRNA在T细胞中的裁剪遵守齐很高，介于52%到70%之间，况兼齐能有用镌汰CD4+和CD8+ T细胞名义CCR5的抒发（CCR5+）。比拟之下，使用假“裁剪”gRNA时，CCR5+细胞的比例判辨减少。

接着，辩论团队将TB48和TB50伙同使用，罗致“双重指示”尺度，模拟CCR5Δ32突变的遵守。这个尺度也能强效裁剪CCR5基因，并镌汰CCR5的抒发。值得一提的是，这些裁剪在培养10天后也曾有用，且莫得不雅察到未裁剪细胞的扩增或CCR5抒发变化。

临了，辩论东说念主员通过AUC分析量化了CCR5+细胞频率的变化，发现TB48、TB50以及双重指示的组合在减少CCR5+ CD4+和CD8+ T细胞的频率方面，比TB7和TB8更有用。

CCR5裁剪使东说念主类CD4+ T细胞具备抗HIV的材干

为了考证CCR5裁剪抵抗HIV的遵守，辩论东说念主员对来自三位不同供体的外周血单核细胞（PBMCs）进行了高剂量的HIV挑战，使用了不同的gRNA裁剪尺度。完结线路，与使用假GFP裁剪的CD4+ T细胞比拟，所有CCR5裁剪的CD4+ T细胞的感染率显赫镌汰。

很是是在测试的三位供体中，使用TB48、TB50和TB48+TB50双重指示进行CCR5裁剪的细胞，在6天后的HIV感染进度与假感染对照组险些换取。

通过对感染细胞频率和感染包袱的分析，辩论发现，TB48、TB50或TB48+TB50双重指示裁剪的细胞，HIV感染频率判辨低于TB7和TB8裁剪的细胞。此外，CCR5+ CD4+ T细胞频率的镌汰与HIV感染频率的减少致密干系。

这些完结标明，CCR5裁剪梗概有用赋予CD4+ T细胞抗HIV的材干，况兼TB48+TB50双重指示尺度具有很大的辩论后劲。

CCR5裁剪不影响东说念主类CD34+ HSPC的弥远移植和造血功能

为了评估高频CCR5裁剪对造血干细胞（HSPC）的影响，辩论东说念主员使用TB48和TB50这两种gRNA与Cas9卵白对三位健康成东说念主的动员造血干细胞进行了电穿孔。

裁剪后48小时，完结线路，三位供体的CCR5裁剪遵守高达91%至97%。电穿孔后的细胞存活率越过95%，况兼不同裁剪条目下，细胞的回收率相当。

在单细胞执行中，辩论发现，无论是使用假裁剪（GFP gRNA）照旧双重gRNA（TB48+TB50）的裁剪，造血干细胞的克隆数量和谱系构成莫得显赫各异。随后，辩论东说念主员将裁剪后的HSPC移植到免疫弱势小鼠中，不雅察其弥远移植遵守。

天然在移植后的一个月内，使用CCR5裁剪的HSPC的小鼠血液中东说念主类CD45+细胞的数量较低，但跟着时分的推移，这一各异缓缓隐藏。

最伏击的是，无论是未裁剪的、假裁剪的，照旧CCR5裁剪的HSPC移植小鼠，红系、髓系和淋巴系东说念主类细胞的散播和比例同样，标明电穿孔过程或高频CCR5裁剪不会影响HSPC的造血后劲。

CCR5缺失的东说念主类造血异种移植的清晰性

辩论东说念主员评估了高频CCR5裁剪对东说念主类造血干细胞（HSPC）移植的清晰性和功能性影响。他们量化了移植了越过90% CCR5裁剪HSPC的小鼠中，髓系细胞（CD33+）和T细胞（CD3+）中CCR5+细胞的变化。

完结线路，这些小鼠的髓系细胞和T细胞险些莫得CCR5抒发，判辨低于移植了未裁剪或假裁剪（GFP）HSPC的小鼠。

在6个月的追踪中，移植了CCR5裁剪HSPC的小鼠中，髓系细胞中CCR5+细胞的比例低于2%，而对照组小鼠为约30%。另外，T细胞也险些莫得CCR5抒发，标明这些细胞对HIV的易理性大大镌汰。

在另一项孤独的辩论中，使用来自另一位健康供体的HSPC进行雷同的裁剪和移植，得回了同样的完结。

这标明，使用双重gRNA尺度高效裁剪CCR5的HSPC，不错形成险些不含CCR5抒发的东说念主类造血移植物，基本终明晰CCR5Δ32/Δ32突变的遵守，提供了HIV防治的新主义。

CCR5 裁剪的频率决定了HIV感染的风险

CCR5裁剪的异种移植小鼠对HIV感染具有免疫樊篱

在移植了TB48 + TB50双重gRNA CCR5裁剪HSPC的小鼠中，CCR5抒发的CD4+ T细胞显赫减少，标明这种移植可能具备对HIV的抗性。

为了考证这少量，辩论东说念主员用高剂量的CCR5趋向性HIV（HIVJRCSF）对小鼠进行挑战，并将CCR5裁剪小鼠与假裁剪（GFP gRNA）对照组进行比较。

完结线路，所有假裁剪小鼠在挑战后齐被感染，且血浆中的HIV RNA水平在2周内大幅高潮，越过了10^3拷贝/mL。而CCR5裁剪的小鼠则有用拒抗了HIV感染，致使在进行五倍剂量的后续挑战后仍未感染。

在对照小鼠中，HIV感染导致CD4+ T细胞快速减少，而CCR5裁剪的小鼠则莫得这种细胞丧失。通过数字滴度PCR（ddPCR）检测，辩论东说念主员在CCR5裁剪小鼠中莫得发现低水平或非坐褥性HIV感染的字据，这些小鼠在挑战后5周的尸检中，淋巴结组织未检出HIV整合DNA。

为了确保保护遵守照实来自CCR5裁剪而非裁剪过程的反作用，辩论东说念主员用CCR5裁剪小鼠再次进行挑战。

尽管这些小鼠生效拒抗了之前的HIVJRCSF感染，但当用替代共受体CXCR4的HIV株（HIVNL43）进行挑战时，小鼠生效感染并推崇出热烈的HIV病毒血症。这阐述CCR5裁剪小鼠的抗HIV遵守是特定于CCR5抒发去除的。

这些完结标明，通过高频CCR5裁剪的东说念主类造血干细胞（HSPC）移植，不错有用重建CD4+ T细胞，并使其对CCR5趋向性HIV产生免疫保护。

CCR5裁剪HSPC的不同剂量对HIV感染偏执病理的影响

在前边的辩论中，移植了越过90% CCR5裁剪东说念主类造血干细胞（HSPC）的小鼠能十足拒抗CCR5趋向性HIV的挑战。但在本体临床中，可能会际遇CCR5裁剪频率较低或者移植生遵守较低的情况。

为了评估较低频率CCR5裁剪的保护遵守，辩论东说念主员在免疫弱势小鼠中进行了执行，移植了不同剂量的CCR5裁剪HSPC，并将其与假裁剪（GFP gRNA）细胞夹杂，构成不同的移植组合。

这项辩论使用了NBSGW小鼠，这种小鼠的突变不错避将就度全身照耀，从而提妙手类造血干细胞（HSPC）的移植遵守。

辩论树立了五个组，分离罗致了100%、75%、50%、25%和0%剂量的CCR5裁剪细胞。完结线路，移植后，CCR5裁剪的频率在不同组间有所不同，分离为26%、54%、69%和96%。

与此同期，移植的CCR5裁剪细胞量与外周血中CD33+髓系细胞和T细胞上CCR5抒发的比例一致。

接下来，这些小鼠每周罗致高剂量CCR5趋向性HIV（HIVJRCSF）挑战，抓续8周，以评估不同CCR5裁剪剂量的保护遵守。

完结线路，CCR5裁剪频率最低（26%）的小鼠组对HIV的易理性与对照组换取，所有小鼠齐感染了HIV。而跟着CCR5裁剪剂量的加多，保护遵守缓缓增强。与前期辩论一致，裁剪比例最高（96%）的组在8次挑战中齐未感染，推崇出十足的保护遵守。

通过生计弧线分析，辩论东说念主员发现，CCR5裁剪频率最低的组（26%）与对照组感染风险莫得显赫各异，挑战中的感染风险为0.28。

而CCR5裁剪比例为54%的组感染风险镌汰了45%（0.16），但这一变化未达到统计学显赫性。比拟之下，CCR5裁剪比例为69%和96%的两组则推崇出了显赫的保护遵守，感染风险分离镌汰了82%（0.051）和100%（十足免疫）。

CCR5裁剪对HIV感染风险的影响偏执机制模子

辩论东说念主员随后分析了所有小鼠的HIV感染数据和CCR5裁剪散播，并劝诱了一个模子，估算CCR5裁剪频率对感染风险的影响。根据该模子，CCR5基因裁剪越过98%的小鼠需要接种越过100次才能感染HIV。

为了更准确评估感染风险，辩论东说念主员根据每只小鼠的本体CCR5裁剪频率，将它们分红五个组。完结线路，CCR5裁剪频率最低的组（0–40%）的小鼠感染率较高，而跟着裁剪频率加多，感染率缓缓下落。

除了CCR5裁剪对HIV感染的保护作用，辩论还探求了CCR5抒发细胞减少对病毒载量的影响。辩论东说念主员以为，跟着CCR5阴性HIV耐受性CD4+ T细胞比例的加多，靶细胞数量下落，最终可能防碍HIV传播，这个状况被称为“传播樊篱”。

分析完结线路，CCR5裁剪较高的小鼠病毒载量较低，未感染的动物数量加多。不外，探求到传播樊篱机制后，模子的拟合遵守并莫得显赫改善，因为在高CCR5裁剪水平下，独一少数小鼠可能会感染。

03论断

这项辩论基于柏林患者的生效陶冶，探讨了使用CRISPR/Cas9期间裁剪动员的CD34+ HSPCs中的CCR5基因，以复制CCR5Δ32/Δ32的保护遵守，激动自体干细胞移植（HSCT）行动休养HIV的一种畴昔应用尺度。

辩论发现，使用两种高效指示RNA不错终了越过90%的CCR5裁剪，同期不会影响干细胞的造血后劲。这标明，CRISPR/Cas9基因裁剪有望复制柏林患者等的生效，并为更畴昔的自体HSCT尺度提供了可能。

辩论标明，弥散高频的CCR5裁剪（大于90%）能有用防护HIV感染，并产生显赫的保护遵守。执行中，高频CCR5裁剪的HSPC移植梗概重建一个对HIV免疫的移植物，且不会显赫影响HSPC的弥远植入后劲。

尽管在高频裁剪组中，短期内移植的东说念主类细胞量有所减少，但这一各异在8周后隐藏，复旧了高频裁剪对弥远造血后劲的影响非常小。此外，辩论还发现，较低频率的CCR5裁剪（如低于90%）天然能镌汰感染风险，但不可十足防碍HIV感染。

在不同频率的CCR5裁剪下，辩论构建了一个模子，瞻望CCR5裁剪频率若何影响ART停药后HIV再激活的风险。

模子瞻望，90%的CCR5裁剪频率能推迟病毒反弹，而98%以上的裁剪频率能推迟至少两个月的病毒反弹。更高频率的CCR5裁剪不仅减少了感染风险，还镌汰了病毒的复制水平，从而为休养计谋提供了“传播樊篱”。

很是值得珍摄的是，辩论瞻望，当CCR5裁剪频率达到87.5%时，靶细胞的数量会减少到病毒无法有用复制的水平，从而无法保管抓续的感染。

这标明，高频CCR5裁剪可能有助于防碍ART停药后HIV的再激活，幸免病毒扩增，尤其是在衰败HIV特异性免疫的情况下。

该辩论为基因裁剪在HIV休养中的应用提供了伏击数据，阐述高频CCR5裁剪的HSPC移植梗概有用防碍HIV感染并蔓延病毒复发。这也为基于自体干细胞移植（HSCT）的HIV休养计谋提供了可行旅途。

跟着CRISPR/Cas9期间遵守栽种及安全性得回招供，畴昔自体HSCT有望成为休养HIV的新遴荐。此外，干系期间在休养镰状细胞病和β-地中海贫血等遗传病的应用也为畴昔HIV休养提供了有劲复旧。

谛视：

CCR5 (C-C chemokine receptor type 5) C-C趋化因子受体5：CCR5是HIV病毒参预细胞的通说念，成为抗HIV休养的关节靶点。

HSPC (Hematopoietic Stem and Progenitor Cells) 造血干细胞偏执前体细胞：HSPC是所有血液细胞的开端，能自我更新并分化成不同血细胞。它们在血液病休养中起着伏击作用。

HSCT (Hematopoietic Stem Cell Transplantation) 造血干细胞移植：HSCT是一种通过移植健康造血干细胞休养血液病的尺度。

gRNA (guide RNA) 指示RNA：gRNA是CRISPR期间中的RNA分子，匡助Cas9卵白准实在割指标DNA，终了基因裁剪。

Cas9 (CRISPR-associated protein 9) CRISPR干系卵白9：Cas9是一种酶，在CRISPR基因裁剪中雅致剪切DNA，匡助终了基因修改。

CD34+ (Cluster of Differentiation 34 positive) CD34阳性：CD34阳性是造血干细胞的记号，伏击于血液细胞的生成与血液病休养。

NBSGW (Nonobese diabetic severe combined immunodeficient (NOD/SCID) with a common gamma chain mutation) 非肥壮型严重集合免疫弱势（NOD/SCID）小鼠，带有共同伽玛链突变：NBSGW小鼠是一种免疫弱势小鼠，常用于免疫辩论和基因休养执行。

著述标题：High frequency CCR5 editing in human hematopoietic stem progenitor cells protects xenograft mice from HIV infection 作家：Claiborne， D.T.， Detwiler， Z.， Docken， S.S. et al. DOI：10.1038/s41467-025-55873-3

编译：松鼠哥萝莉 telegram